ViralStars LP LentivirusPackagingKit

　　CatalogNumber：LP110

01/ViralStars 慢病毒包裝試劑盒產(chǎn)品概述

　　慢病毒是一種有包膜的RNA病毒，直徑為80-120nm，呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)、球形。病毒顆粒最外層是包膜（包膜蛋白決定了感染細(xì)胞的類型），再往里依次為基質(zhì)蛋白和衣殼，最里面是兩條相同的正股RNA鏈和酶（逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶）。

　　慢病毒表達(dá)載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)?？商峁┌b重組慢病毒載體所需的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，可以直接或濃縮后用于宿主細(xì)胞的感染。

　　慢病毒感染細(xì)胞的第一步是通過包膜蛋白與細(xì)胞表面受體結(jié)合。慢病毒與宿主細(xì)胞膜融合后釋放結(jié)構(gòu)蛋白、酶蛋白和病毒核心。病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄并與整合酶形成整合前復(fù)合物。整合前復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核后，整合酶催化其整合至宿主基因組。整合后的DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA，回到細(xì)胞漿中，表達(dá)目的蛋白或產(chǎn)生RNAi干擾。

　　ViralStars慢病毒包裝試劑盒LentivirusPackagingKit屬于第二代慢病毒包裝體系，同時可兼容第二代和第三代慢病毒包裝質(zhì)粒。慢病毒中的毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒，即產(chǎn)生的慢病毒感染目的細(xì)胞后不會再感染其他細(xì)胞，也不會利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒顆粒。ViralStarsLPTMLentivirusPackagingKit包裝的慢病毒具有感染效率高、感染譜廣等特點，可實現(xiàn)外源基因在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)。經(jīng)該試劑盒包裝獲得的對照質(zhì)粒病毒滴度可達(dá)108TU/mL。

　　ViralStars慢病毒包裝試劑盒包含如下組分：

　　(1)優(yōu)化配比的慢病毒包裝輔助質(zhì)?；旌衔铮≒ackagePlasmidMix），經(jīng)過設(shè)計調(diào)整，可兼容大多數(shù)慢病毒表達(dá)載體，確保將重組子包裝成具有高感染率的慢病毒顆粒。

　　(2)表達(dá)GFP和Puro標(biāo)記的對照質(zhì)粒（ControlPlasmid），便于觀察病毒包裝效率及測定病毒滴度。

　　(3)高效轉(zhuǎn)染試劑（PolyShooterTransfectionReagent），具有更高的轉(zhuǎn)染效率和更低的細(xì)胞毒性。

　　(4)常用病毒感染增強(qiáng)試劑Polybrene，能夠顯著提高病毒與細(xì)胞的接觸及感染效率。

02/產(chǎn)品組分

03/保存條件：冰袋（wetice）運輸。-20℃保存，有效期12個月。

04/產(chǎn)品特點

　　簡單快速——操作簡單，無需對包裝輔助質(zhì)粒進(jìn)行抽提，也無需對包裝體系進(jìn)行優(yōu)化

　　病毒滴度高——可包裝出高滴度、高表達(dá)水平的慢病毒

　　應(yīng)用范圍廣——經(jīng)過設(shè)計及優(yōu)化配比，兼容大多數(shù)慢病毒表達(dá)載體

05/實驗流程概要

06/ViralStars 慢病毒包裝試劑盒實驗步驟

一、重組慢病毒制備

　　1.細(xì)胞準(zhǔn)備

　　轉(zhuǎn)染前一天，將4-6×106個293T細(xì)胞接種到10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，使其在包裝時密度為70%-80%，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h～24h。

　　?細(xì)胞狀態(tài)會極大影響病毒包裝效率，待包裝細(xì)胞應(yīng)處于良好生長狀態(tài)，建議使用生長處于指數(shù)期、存活率大于90%的細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝。

　　?該包裝系統(tǒng)與ViralStarsTMLentivirusPackagingCellLine（CL110001）配合使用，可包裝出更高滴度、更高表達(dá)水平的慢病毒。

　　2.慢病毒包裝

　　(1)取10μL慢病毒包裝輔助質(zhì)?；旌衔铮≒ackagePlasmidMix）加入到2mL離心管中，加入2.5μg含有目的基因的慢病毒載體質(zhì)粒，輕輕混合，加入32μLPolyShooter轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)?；旌?，室溫孵育3分鐘。

　　?慢病毒載體質(zhì)粒需根據(jù)研究基因自行構(gòu)建，應(yīng)使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，保證質(zhì)粒A260/A280比值為1.8-2.0，濃度不低于500ng/μL。溶解后的質(zhì)粒切忌反復(fù)凍融，需按照使用量進(jìn)行分裝并于-20℃保存。

　　(2)往上述混合物中加入1.8mL無血清無雙抗的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，輕輕混勻，在室溫下靜置30分鐘，形成轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

　　?轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物在室溫下4個小時內(nèi)保持穩(wěn)定。

　　(3)將上述1.8mL轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物輕輕地逐滴均勻加入10cm皿293T細(xì)胞中，輕輕搖動培養(yǎng)皿混勻，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)產(chǎn)毒。

　　3.收獲病毒

　　(1)轉(zhuǎn)染24h后，可選擇棄去初始病毒上清液，加入10-15mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS)至10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)(此步驟可選)。

　　(2)轉(zhuǎn)染48h后，收集病毒上清液，再加入10-15mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS)至10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

　　(3)轉(zhuǎn)染72h后，觀察細(xì)胞狀態(tài)并拍照，進(jìn)行二次病毒上清液收集，與48h收集的上清液混合，300xg離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片，使用0.22μm濾器過濾，過濾后的上清液可直接感染目的細(xì)胞，或使用慢病毒濃縮試劑盒(LC110R)濃縮后感染目的細(xì)胞。

　　?切忌反復(fù)凍融病毒，凍融一次病毒滴度將降低10-20%。-80℃保存的慢病毒最好在半年內(nèi)使用。

二、VirusStars慢病毒包裝試劑盒LP110病毒滴度測定

　　1.孔稀釋法標(biāo)定帶熒光的重組慢病毒滴度

　　(1)Day1：準(zhǔn)備細(xì)胞

　　對生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞消化計數(shù)后稀釋至?1-3x105個?/mL?，加入96孔板，100?μL/孔（1-3x104個?/孔），每?種慢病毒設(shè)6個梯度孔，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　　(2)Day2：病毒的稀釋與感染

　　在EP管中做10倍梯度稀釋，連續(xù)6個稀釋梯度。稀釋方法如下：準(zhǔn)備6個?菌EP管，每個EP管中加?90μL新鮮的*培養(yǎng)基（含10μg/mLpolybrene），取待測定病毒液10μL加?到第?個EP管中（標(biāo)記10μL），混勻后取10μL病毒稀釋液加?到第?個EP管中（標(biāo)記1μL），以此類推，直到稀釋到最后?管。棄去96孔板中原有的培養(yǎng)基，將稀釋好的病毒依次加入孔中，并做好標(biāo)記，??操作，不要吹起細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h。如需設(shè)置復(fù)孔，則按復(fù)孔的數(shù)量倍數(shù)增加以上用量。

(3)Day3：棄病毒，換液吸去含病毒的培養(yǎng)基，在每個孔中再加入?100μL?預(yù)熱的新鮮*培養(yǎng)基。

　　(4)Day4：熒光計數(shù)與滴度計算

　　方法1：末位稀釋計數(shù)法

　　感染36-48h后，用熒光顯微鏡對熒光陽性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。數(shù)出最后兩孔的熒光細(xì)胞數(shù)(若設(shè)置了復(fù)孔，則計算復(fù)孔內(nèi)的總數(shù)之和并計算出平均數(shù))，假設(shè)為A(倒數(shù)第二孔的熒光細(xì)胞數(shù)）和B（倒數(shù)第一孔的熒光細(xì)胞數(shù))。

　　慢病毒滴度計算公式1：病毒滴度(TU/mL)=（A+B×10）×1000/2/A孔病毒量（μL）

　　舉例1：5號管對應(yīng)的熒光陽性細(xì)胞數(shù)為10個，6號管對應(yīng)的熒光陽性細(xì)胞數(shù)為2個，則病毒滴度為：

　　滴度（TU/mL）=?（?10+2x10）x1000/2/0.001?=?1.5x107

　　如果需要感染?2x105個細(xì)胞，MOI=5（1個細(xì)胞對應(yīng)5個病毒顆粒），則需病毒體積為：

　　所需病毒體積?=?2?x105x?5/1.5x107（mL）=?0.067?mL?=?67?μL

　　方法2：適量熒光計數(shù)法

　　感染36-48h后，用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)對熒光比例合適（10%-50%）的連續(xù)兩個梯度進(jìn)行統(tǒng)計，數(shù)出兩孔的熒光細(xì)胞數(shù)(若設(shè)置了復(fù)孔，則計算復(fù)孔內(nèi)的總數(shù)之和并計算出平均數(shù))，假設(shè)為C（較高濃度孔的熒光細(xì)胞數(shù)）和D（較低濃度孔的熒光細(xì)胞數(shù)）。

　　慢病毒滴度計算公式2：病毒滴度(TU/mL)=（C+D×10）×1000/2/C孔病毒量（μL）

　　舉例2：3號管對應(yīng)的熒光陽性細(xì)胞數(shù)為10000個，4號管對應(yīng)的熒光陽性細(xì)胞數(shù)為2000個，則病毒滴度為：

　　滴度（TU/mL）=?（?10000+2000x10）x1000/2/0.1?=?1.5x108

　　如果需要感染?2x105個細(xì)胞，MOI=30（1個細(xì)胞對應(yīng)30個病毒顆粒），則需病毒體積為：

　　所需病毒體積?=?2?x105x?30/1.5x108（mL）=?0.04?mL?=?40?μL

　　2.相對定量PCR標(biāo)定非熒光的重組慢病毒滴度

　　(1)Day1：準(zhǔn)備細(xì)胞

　　對生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞消化計數(shù)后稀釋至1-3x105個?/mL?，加入24孔板，500?μL/孔（?0.5-1.5x105個?/孔），每?種慢病毒設(shè)6個梯度孔，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　　(2)Day2：病毒的稀釋與感染

　　在EP管中做10倍梯度稀釋，連續(xù)6個稀釋梯度。稀釋方法如下：準(zhǔn)備6個?菌EP管，每個EP管中加?450μL新鮮的*培養(yǎng)基（含10μg/mLpolybrene），取待測定病毒液50μL加?到第?個EP管中（標(biāo)記50μL），混勻后取50μL病毒稀釋液加?到第?個EP管中（標(biāo)記5μL），以此類推，直到稀釋到最后?管。棄去24孔板中原有的培養(yǎng)基，將稀釋好的病毒依次加入孔中，并做好標(biāo)記，??操作，不要吹起細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h。如需設(shè)置復(fù)孔，則按復(fù)孔的數(shù)量倍數(shù)增加以上用量。

(3)Day3：棄病毒，換液吸去含病毒的培養(yǎng)基，在每個孔中再加入?500μL?預(yù)熱的新鮮*培養(yǎng)基。

　　(4)Day4：相對定量PCR與滴度計算

　　用PBS清洗并將細(xì)胞吹打下來，離心收集細(xì)胞，進(jìn)行基因組DNA的提取，qPCR檢測。以被測慢病毒載體梯度稀釋為標(biāo)準(zhǔn)品，慢病毒載體上的通用引物進(jìn)行qPCR以獲得病毒整合拷貝數(shù)。以Actin質(zhì)粒梯度稀釋為標(biāo)準(zhǔn)品，Actin引物進(jìn)行qPCR檢測樣品的基因組拷貝數(shù)以得到基因組拷貝數(shù)。

　　慢病毒滴度計算公式3：滴度（IU/mL）=(E×N×1000)/對應(yīng)孔病毒量（μL），其中E=平均每基因組慢病毒整合拷貝數(shù)，N=感染時細(xì)胞的數(shù)目（約為1.5×105）。

　　?測定時，設(shè)置一組帶熒光的已知TU的慢病毒作為對照，以校驗檢測出的數(shù)值。

三、慢病毒感染目的細(xì)胞

　　VSVG包膜蛋白對不同的細(xì)胞和組織的親嗜性有很大差異，在使用慢病毒感染目的細(xì)胞之前，需要查閱相關(guān)文獻(xiàn)或進(jìn)行預(yù)實驗確定目的細(xì)胞的復(fù)感染指數(shù)（MOI，multiplicityofinfection）。

　　1.按照上述步驟包裝慢病毒及確定慢病毒滴度，通過病毒滴度和MOI計算所需病毒量（計算公式參考06/實驗步驟/病毒滴度測定）。

　　2.實驗前一天，將生長狀態(tài)良好的目的細(xì)胞消化計數(shù)后稀釋至1-3×105/mL，加入12孔板，1mL/孔。放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　　?懸浮細(xì)胞不需要提前一天接種，實驗前將細(xì)胞計數(shù)接種后，直接加入病毒混合液即可。

　　3.配制慢病毒+polybrene+培養(yǎng)基混合液。polybrene為常用的促感染試劑，能夠顯著提高病毒與細(xì)胞的接觸及感染效率，一般使用濃度為2-10μg/mL，但對某些細(xì)胞（如末端分化的神經(jīng)元，DC細(xì)胞等）毒性較大，初次使用建議先做毒性測試。

　　4.吸去12孔板中目的細(xì)胞的培養(yǎng)基，加入3中配制的慢病毒混合液，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

　　?感染懸浮細(xì)胞或半懸浮細(xì)胞，則需采用平角離心轉(zhuǎn)染法，即將適量的病毒液加入細(xì)胞培養(yǎng)板后，封好口，放入平角離心機(jī)中，低速（200xg）離心?1h?，然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

　　?若實驗條件有限，沒有平角離心機(jī)，可用離心管代替，將細(xì)胞吸入離心管中，進(jìn)行低速離心，去掉大部分上清，加入適量的病毒液，室溫放置?15min，然后將細(xì)胞和病毒液同時吸出轉(zhuǎn)入培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。

　　5.病毒感染16h后更換為新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

　　6.病毒感染36-48h后，熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況。

　　7.若表達(dá)效果不理想，可調(diào)整MOI（例如，設(shè)置MOI梯度）再次檢測。

　　07/適用范圍

　　兼容大多數(shù)慢病毒表達(dá)載體，經(jīng)過設(shè)計及優(yōu)化配比，確保將重組子包裝成具有高感染率的慢病毒顆粒，同時防止病毒的自我復(fù)制。

08/注意事項

　　1.該系統(tǒng)與ViralStarsLentivirusPackagingCellLine（CL110001）配合使用，可包裝出更高滴度、更高表達(dá)水平的慢病毒。

　　2.在收獲粗病毒后，建議額外分裝幾支20-100µL小體積管，和其他分裝的大體積病毒一并置于-80℃保存。待這些小體積病毒結(jié)冰后，取出來融化，再測定滴度。這一步可以模擬一次凍融帶來的活性滴度下降，這樣測得的滴度才是真正具有參考價值的。

　　3.為了您的健康安全，請規(guī)范操作，穿戴實驗服與手套開展實驗。

　　4.所有慢病毒操作均需在生物安全柜（BSL2級）中進(jìn)行。

　　5.本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及治療。

　　09/實驗案例分析

　　1.提前一天使用10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)ViralStarsLentivirusPackagingCellLine（CL110001），待細(xì)胞密度為75%左右開始包裝慢病毒。

　　2.使用ViralStarsTMLPLentivirusPackagingKit（LP110-10）進(jìn)行慢病毒包裝。取10μL慢病毒包裝輔助質(zhì)粒混合物（PackagePlasmidMix）加入到2mL離心管中，加入2.5μL表達(dá)GFP的對照質(zhì)粒（ControlPlasmid），輕輕混合，加入32μLPolyShooter轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)?；旌?，室溫孵育3分鐘。

　　3.往上述混合物中加入1.8mL無血清無雙抗的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，輕輕混勻，在室溫下靜置30分鐘，形成轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

　　4.將上述1.8mL轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物輕輕地逐滴均勻加入10cm皿慢病毒包裝細(xì)胞中，輕輕搖動培養(yǎng)皿混勻，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)產(chǎn)毒。

　　5.轉(zhuǎn)染24h后，棄去初始病毒上清液，加入10mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS)至10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

　　6.轉(zhuǎn)染48h后，收集病毒上清液，再加入10mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS)至10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

　　7.轉(zhuǎn)染72h后，觀察細(xì)胞狀態(tài)并拍照，進(jìn)行二次病毒上清液收集，與48h收集的上清液混合后，300xg離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片，0.22μm濾器過濾，使用ViralStarsLCLentivirusConcentrationSolution慢病毒濃縮試劑盒（LC110R）進(jìn)行20倍濃縮，使用1mLViralStarsLSLentivirusStorageSolution（LS110R）重懸慢病毒顆粒。

　　8.孔稀釋法測定病毒滴度（參考06/實驗步驟中病毒滴度測定方法），使用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，并拍照記錄，實驗結(jié)果如圖2所示。