ViralStarsTMLentivirusPackagingCellLine

　　CatalogNumber：CL110001

01/VirusStars慢病毒包裝細(xì)胞系CL110001產(chǎn)品概述

　　慢病毒是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，能使外源基因整合入宿主細(xì)胞的基因組，實(shí)現(xiàn)外源基因穩(wěn)定、長期的表達(dá)，比一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒具有更高的滴度和更廣的宿主范圍。攜帶外源基因的慢病毒載體與包裝載體（產(chǎn)生病毒顆粒所需的輔助蛋白）一同轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，即可進(jìn)行病毒的包裝。包裝好的慢病毒為假型病毒（病毒感染目的細(xì)胞后不會(huì)再感染其他細(xì)胞，也不會(huì)利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒顆粒，慢病毒中的毒性基因已被剔除并被外源性目的基因所取代），分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，經(jīng)過離心取得上清液后進(jìn)行慢病毒濃縮，濃縮后的慢病毒液可以直接用于宿主細(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而實(shí)現(xiàn)外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)（下圖）。

要充分利用慢病毒包裝系統(tǒng)產(chǎn)生高滴度的慢病毒顆粒，就需要宿主細(xì)胞系具備易于轉(zhuǎn)染并且可以高水平表達(dá)病毒蛋白質(zhì)的特性。我們的ViralStars慢病毒包裝細(xì)胞系LentivirusPackagingCellLine經(jīng)過了克隆篩選，可以充分滿足這些需求。當(dāng)與我們優(yōu)質(zhì)的ViralStarsLPLentivirusPackagingKit（LP110）高滴度慢病毒包裝試劑盒配合使用時(shí)，可以獲得更高的慢病毒滴度（高達(dá)108TU/mL）。ViralStars慢病毒包裝細(xì)胞系是人胚胎腎細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞HEK293的亞克隆，經(jīng)過基因編輯改進(jìn)后篩選出的單克隆細(xì)胞株，具備高細(xì)胞活性、低細(xì)胞凋亡水平、可高度轉(zhuǎn)染并高水平表達(dá)病毒蛋白質(zhì)等特性。

02/產(chǎn)品組分

03/保存條件：為確保細(xì)胞活力，細(xì)胞產(chǎn)品接收后應(yīng)立即進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及后續(xù)操作（詳見05/實(shí)驗(yàn)步驟）。

04/產(chǎn)品特點(diǎn)

　　1.高細(xì)胞活性、低細(xì)胞凋亡水平

　　2.高度易于轉(zhuǎn)染

　　3.高水平表達(dá)重組慢病毒

05/VirusStars慢病毒包裝細(xì)胞系CL110001實(shí)驗(yàn)步驟

一、ViralStars^TM LentivirusPackagingCellLine細(xì)胞傳代

　　1.待細(xì)胞密度達(dá)90%左右，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。棄去舊培養(yǎng)基，用PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

　　2.加入適量消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化細(xì)胞約1-2分鐘，顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若觀察到大部分細(xì)胞變圓并脫落，則迅速拿回操作臺(tái)，加入與消化液等量的*培養(yǎng)基（DMEM，10%FBS，1%雙抗）終止消化。

　　3.輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞*脫落后吸出，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

　　4.將細(xì)胞懸液按合適的比例（推薦1:4-1:5）接種到新的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

二、ViralStars^TM LentivirusPackagingCellLine細(xì)胞凍存

　　1.選擇處于指數(shù)生長期的細(xì)胞，按照常規(guī)方法收集細(xì)胞于離心管中。

　　2.1000rpm，離心5分鐘，收集培養(yǎng)細(xì)胞沉淀，棄上清液。

　　3.加入適量4℃預(yù)冷的LeapWalCellFreezingMedium(1x)(PZ110R)重懸細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。

　　?按照細(xì)胞密度和所用細(xì)胞凍存管的尺寸計(jì)算所需凍存液的量，推薦凍存密度：1x106至5x106cells/mL。

　　4.將細(xì)胞懸液分裝至已標(biāo)記的凍存管中，建議每管1mL或1.5mL。

　　5.直接將細(xì)胞凍存管放入-80℃超低溫冰箱中，可長期冷凍保存。如果想放入液氮中長期保存，需先放入-80℃冰箱至少12小時(shí)，方可移至液氮罐中長期保存。

三、ViralStars^TM LentivirusPackagingCellLine細(xì)胞復(fù)蘇

　　1.在15mL離心管中加入5-10mL平衡至室溫的*培養(yǎng)基。

　　2.從-80℃冰箱/液氮中取出凍存的細(xì)胞，立即放入37℃水浴鍋或其他細(xì)胞復(fù)蘇設(shè)備中，迅速解凍。

　　3.將凍存管中的細(xì)胞懸液逐滴轉(zhuǎn)移至預(yù)先準(zhǔn)備好的含*培養(yǎng)基的離心管中，1000rpm，離心5分鐘，收集細(xì)胞沉淀，棄上清（操作時(shí)小心，切勿將細(xì)胞沉淀移去）。

　　4.加入適量平衡至室溫的*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種到事先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)容器中，輕輕搖晃培養(yǎng)容器，使細(xì)胞分布均勻。

　　5.培養(yǎng)5-16h后，觀察細(xì)胞狀態(tài)，可視情況更換預(yù)熱的新鮮*培養(yǎng)液，之后進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)及傳代。

06/VirusStars慢病毒包裝細(xì)胞系CL110001適用范圍

　　ViralStars^TM LentivirusPackagingCellLine經(jīng)過了基因編輯及單克隆篩選，具備高細(xì)胞活性、低細(xì)胞凋亡水平、可高度轉(zhuǎn)染并高水平表達(dá)病毒蛋白等特性，兼容所有慢病毒包裝體系。

07/注意事項(xiàng)

　　1.該產(chǎn)品與我們優(yōu)質(zhì)的ViralStarsLPLentivirusPackagingKit（LP110）高滴度慢病毒包裝試劑盒配合使用時(shí)，可以獲得更高的慢病毒滴度（高達(dá)108TU/mL）。

　　2.為了您的健康安全，請(qǐng)規(guī)范操作，穿戴實(shí)驗(yàn)服與手套開展實(shí)驗(yàn)。

　　3.所有慢病毒操作均需在生物安全柜(BSL2級(jí))中進(jìn)行。

　　4.本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及治療。

08/實(shí)驗(yàn)案例分析

　　1.提前一天使用10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)ViralStarsTMLentivirusPackagingCellLine（CL110001）及其它兩種常用HEK293包裝細(xì)胞系（HEK293T、293FT），待細(xì)胞密度為75%左右開始包裝慢病毒。

　　2.使用ViralStarsLPLentivirusPackagingKit（LP110-10）進(jìn)行慢病毒包裝。取3個(gè)2mLEP管，分別加入10μL慢病毒包裝輔助質(zhì)?；旌衔铮≒ackagePlasmidMix），2.5μL表達(dá)GFP的對(duì)照質(zhì)粒（ControlPlasmid），輕輕混合，加入32μLPolyShooter轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)?；旌?，室溫孵育3分鐘。

　　3.往上述混合物中加入1.8mL無血清無雙抗的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，輕輕混勻，在室溫下靜置30分鐘，形成轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

　　4.將上述1.8mL轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物輕輕地逐滴均勻加入10cm皿慢病毒包裝細(xì)胞中，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿混勻，做好標(biāo)記，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)產(chǎn)毒。

　　5.轉(zhuǎn)染24h后，棄去初始病毒上清液，加入10mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS)至10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

　　6.轉(zhuǎn)染48h后，收集病毒上清液，再加入10mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS)至10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

　　7.轉(zhuǎn)染72h后，進(jìn)行二次病毒上清液收集，與48h收集的上清液混合后，300xg離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片，0.22μm濾器過濾，使用ViralStarsLCLentivirusConcentrationSolution慢病毒濃縮試劑盒（LC110R）進(jìn)行20倍濃縮，使用1mLViralStarsLSLentivirusStorageSolution（LS110R）分別重懸三組慢病毒顆粒。

　　8.孔稀釋法測定病毒滴度。

　　(1)Day1：準(zhǔn)備細(xì)胞

　　對(duì)生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至?1-3x105個(gè)?/mL?，加入96孔板，100?μL/孔（1-3x104個(gè)?/孔），每?種慢病毒設(shè)6個(gè)梯度孔，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　　(2)Day2：病毒的稀釋與感染

　　在EP管中做10倍梯度稀釋，連續(xù)6個(gè)稀釋梯度。稀釋方法如下：準(zhǔn)備6個(gè)?菌EP管，每個(gè)EP管中加?90μL新鮮的*培養(yǎng)基（含10μg/mLpolybrene），取待測定病毒液10μL加?到第?個(gè)EP管中（標(biāo)記10μL），混勻后取10μL病毒稀釋液加?到第?個(gè)EP管中（標(biāo)記1μL），以此類推，直到稀釋到最后?管。棄去96孔板中原有的培養(yǎng)基，將稀釋好的病毒依次加入孔中，并做好標(biāo)記，??操作，不要吹起細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h。

(3)Day3：棄病毒，換液吸去含病毒的培養(yǎng)基，在每個(gè)孔中再加入?100μL?預(yù)熱的新鮮*培養(yǎng)基。

　　(4)Day4：熒光計(jì)數(shù)與滴度計(jì)算

　　感染36-48h后，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)熒光比例合適（10%-50%）的連續(xù)兩個(gè)梯度進(jìn)行陽性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)，計(jì)算出病毒滴度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2: ViralStars^TM Lentivirus Packaging Cell Line慢病毒包裝細(xì)胞系可制備出更高滴度的慢病毒顆粒。

我們使用ViralStarsLPLentivirusPackagingKit（LP110-10）進(jìn)行慢病毒包裝，比較ViralStarsTMLentivirusPackagingCellLine和其它兩種常用HEK293包裝細(xì)胞系的病毒制備能力，ViralStarsTMLentivirusPackagingCellLine明顯優(yōu)于其他細(xì)胞系——所獲得的病毒滴度比293FT細(xì)胞高出10倍，比親代HEK293細(xì)胞系高出26倍。

09/其他相關(guān)產(chǎn)品