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VirusStars 慢病毒包裝細胞系 CL110001的制備方法

更新時間:2022-12-21 點擊量:932
  慢病毒載體(Lentiviral vector)較逆轉錄病毒載體有更廣的宿主范圍,慢病毒能夠有效感染非周期性和有絲分裂后的細胞。慢病毒載體能夠產生表達siRNA的高滴度的慢病毒,在周期性和非周期性細胞、干細胞、受精卵以及分化的后代細胞中表達siRNA/miRNA,實現在多種類型的細胞和轉基因小鼠中特異而穩(wěn)定的基因表達的功能性沉默,為在原代的人和動物細胞組織中快速研究基因功能,以及產生特定基因表達降低的動物提供了可能性。
 
  VirusStars 慢病毒包裝細胞系 CL110001制備:
 
  細胞:慢病毒包裝常用人胚腎細胞(HEK, human embryonic kidney)293  T,其含有SV40病毒的大T抗原蛋白編碼基因,轉染效率高。但其貼壁性不好,所以需要使用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿增加其吸附性。多聚賴氨酸培養(yǎng)皿可購買,也可自行制備。轉染前,細胞密度控制在40-70%比較好。
 
  DNA:每10 cm培養(yǎng)皿約含5x106 293T細胞,需用30-40 ug不含內毒素的質粒進行轉染。質粒的純度對慢病毒載體的包裝效率非常關鍵。不同的包膜蛋白表達載體,其使用量也不同。
 
  轉染:經濟的轉染方法是磷酸鈣轉染法,雖然其溶液配置影響因素多,不易穩(wěn)定重復得到轉染結果。其它方法有脂質體法和PEI法。轉染48-60后可以收集上清,通過低速離心,然后濾膜過濾可以去除上清中的細胞碎片。
 
  如果使用VSV-G包膜蛋白的話,可以通過兩次超速離心進行濃縮,從而可以獲得滴度高達1011-1012IU/ml的慢病毒載體。之后可以將病毒載體溶解在PBS, HBSS或者DMEM中,并置于-800C儲存。
 
  儲存溶液添加血清會幫助提高病毒凍融時的存活率,然而有些病毒在侵染細胞時,血清會有干擾,所以需要依據具體病毒種類考慮是否添加血清。
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